1

cDNA産量的(de)很低(dī)

可(kě)能的(de)原因：
＊RNA模闆質量低(dī)
＊對mRNA濃度估計過高(gāo)
＊反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足
＊同位素磷32過期
＊反應體積過大，不應超過50μl

2

 擴增産物在電泳分析時沒有(yǒu)條帶或條帶很淺

＊最常見的(de)原因在于您的(de)反應體系是PCR的(de)反應體系而不是RT-PCR的(de)反應體系
＊與反應起始時RNA的(de)總量及純度有(yǒu)關(guān)
＊建議在試驗中加入對照RNA
＊第一(yī)鍊的(de)反應産物在進行(xíng)PCR擴增時，在總的(de)反應體系中的(de)含量不要超過1/10
＊建議用Oligo(dT)或随機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一(yī)鍊合成。由于RNA模闆存在二級結構，如(rú)環狀結果，有(yǒu)可(kě)能導緻GSP無法與模闆退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行(xíng)有(yǒu)效延伸。
＊目的(de)mRNA中含有(yǒu)強的(de)轉錄中止位點，可(kě)以試用以下方法解決：
a. 将第一(yī)鍊的(de)反應溫度提高(gāo)至50℃。
b. 使用随機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進行(xíng)第一(yī)鍊反應。

3

産生非特異性條帶

＊用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如(rú)果RT陰性對照的(de)PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理(lǐ)樣品。
＊在PCR反應中，非特異的(de)起始擴增将導緻産生非特異性結果。在低(dī)于引物Tm 2至5℃的(de)溫度下進行(xíng)退火，降低(dī)鎂離(lí)子(zǐ)或是目的(de)DNA的(de)量将減少非特異性結果的(de)産生。
＊由于mRNA剪切方式的(de)不同，根據選擇引物的(de)不同将導緻産生不同的(de)RT-PCR結果。

4

産生彌散（smear）條帶

＊在PCR反應體系中第一(yī)鍊産物的(de)含量過高(gāo)
＊減少引物的(de)用量
＊優化PCR反應條件/減少PCR的(de)循環次數
＊在用DNase處理(lǐ)被DNA污染的(de)RNA樣品時，其産生的(de)寡核苷酸片段會産生非特異性擴增，一(yī)般會顯示為(wèi)彌散背景。

5

産生大分子(zǐ)量的(de)彌散條帶

＊大多數情況下是由于退火溫度過低(dī)而導緻的(de)非特異性的(de)起始及延伸産生的(de)
＊對于長(cháng)片段的(de)PCR，建議将反應體系中cDNA的(de)濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6

在無反轉錄酶的(de)情況下，對照RNA獲得擴增結果

＊通常是由于對照RNA中含有(yǒu)痕量DNA而導緻的(de)。由于進行(xíng)體外轉錄時不可(kě)能将所有(yǒu)的(de)DNA模闆消除。建議可(kě)将第一(yī)鍊cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的(de)影響。
＊有(yǒu)可(kě)能是引物二聚體的(de)條帶

7

 擴增産物滞留在加樣孔中

＊有(yǒu)可(kě)能是由于模闆量過高(gāo)而導緻PCR結果産生了高(gāo)分子(zǐ)量的(de)DNA膠狀物。建議将第一(yī)鍊結果至少稀釋100倍再進行(xíng)二次擴增。

＊另外，在二次PCR時使用的(de)退火溫度如(rú)果比引物的(de)Tm值低(dī)5℃，可(kě)以将退火溫度适當增高(gāo)或進行(xíng)熱啟動以提高(gāo)特異性。

8

SSⅢ與SSⅡ有(yǒu)何不同？

＊具有(yǒu)更高(gāo)的(de)熱穩定性（達50℃）
＊具有(yǒu)更長(cháng)的(de)半衰期（達220分鐘）
＊對PCR無抑制
＊幹冰運輸
＊Tdt活性更低(dī)

9

為(wèi)什麼有(yǒu)人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如(rú)果保存不當會引起活性很快降低(dī)，SSⅢ則更穩定。

10

為(wèi)什麼使用基因特異性引物（GSP）？

GSP在擴增低(dī)豐度的(de)轉錄本時是最好的(de)。OligodT引物建議用于高(gāo)質量RNA及全長(cháng)轉錄本的(de)逆轉錄；随機(jī)引物用于mRNA片段的(de)逆轉錄。

11

什麼情況下需要使用RNase H？

在第一(yī)輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時。

12

根據不同的(de)目的(de)選擇不同的(de)系統

目的(de) 建議
RT與PCR使用不同的(de)引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統
高(gāo)靈敏度 一(yī)步法或兩步法RT-PCR系統
高(gāo)特異性 含有(yǒu)适當的(de)DNA聚合酶的(de)兩步法RT-PCR系統
或具有(yǒu)高(gāo)保真Platinum Taq酶的(de)一(yī)步法RT-PCR系統
高(gāo)保真度 含有(yǒu)Pfx Taq酶的(de)兩步法RT-PCR系統
長(cháng)的(de)反轉錄結果 通常使用兩步法RT-PCR系統可(kě)達到最佳結果
含Elongase酶的(de)一(yī)步法RT-PCR系統

13

如(rú)何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）

使用5’或3’RACE試劑都需要至少一(yī)條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：
＊50-70％的(de)GC含量，以提高(gāo)引物熔點（Tm）
＊23-28個堿基長(cháng)度，以提高(gāo)引物特異性
＊降低(dī)3’端GC含量，将引物非特異性結合的(de)可(kě)能性降至最低(dī)

14

為(wèi)什麼得不到RACE産物？

＊加入Hela對照

＊低(dī)質量的(de)RNA模闆
＊逆轉錄失敗，SSII和(hé)SSIII非常适用于長(cháng)模闆cDNA的(de)合成
＊目的(de)基因豐度太低(dī)，可(kě)以通過提高(gāo)PCR的(de)循環次數來解決，建議使用巢式PCR
＊目的(de)基因沒有(yǒu)表達，可(kě)以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有(yǒu)目的(de)基因
＊目的(de)基因太長(cháng)而不适合進行(xíng)反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的(de)Oligo dT來得到全長(cháng)cDNA，使用随機(jī)引物或與模闆的(de)5’端盡可(kě)能近的(de)GSP進行(xíng)PCR。
＊cDNA模闆屬于困難模闆，可(kě)以通過以下方法解決：優化PCR反應參數及反應體系；降低(dī)退火溫度；使用5-10％的(de)DMSO幫助通過高(gāo)GC含量區；使用高(gāo)保真度和(hé)高(gāo)延伸能力的(de)酶進行(xíng)PCR反應。

15

RACE的(de)PCR結果有(yǒu)雜帶

RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可(kě)能是由于以下原因：
＊GSP與其他cDNA的(de)非特異性結合會導緻在擴增目的(de)産物時得到無關(guān)産物。
＊GeneRacer引物和(hé)cDNA的(de)非特異性結合會導緻産生一(yī)端帶有(yǒu)GeneRacer引物序列的(de)PCR産物。
＊RNA降解。
＊PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一(yī)般是因為(wèi)沒有(yǒu)優化PCR條件，可(kě)以加入陰性對照來确定。

16

得不到全長(cháng)的(de)5’RACE PCR産物

＊CIP反應後的(de)RNA降解産生了新的(de)帶有(yǒu)5’磷酸的(de)斷裂模闆，可(kě)以同GeneRacer RNA Oligo連接。一(yī)定要小心操作，保證RNA無降解。

＊CIP脫磷酸不完全，可(kě)以增加反應中CIP的(de)量或減少RNA的(de)量。
＊PCR産生了雜帶，并不是真正的(de)連接産物，可(kě)以使用上述建議優化PCR。

17

PCR

在進行(xíng)PCR時：

＊請确保您沒有(yǒu)使用過量的(de)起始DNA或者過高(gāo)濃度的(de)引物，也沒有(yǒu)加入過量的(de)Mg++
＊請确保您使用了恰當的(de)退火溫度
＊請确保您沒有(yǒu)使用過量的(de)DNA聚合酶

18

引物

① 應該選擇哪種純化方法？
取決于實驗目的(de)和(hé)引物的(de)長(cháng)度
②為(wèi)什麼我(wǒ)訂購了50nmol，但是收到卻隻有(yǒu)40nmol？
50nmol是起始量
③ 怎樣制備100μM的(de)儲液？
體積（μl）=質檢報告上的(de)nmol數目×10
④ 怎樣設計引物？
＊一(yī)般長(cháng)度20-30bp；
＊至少50%的(de)GC含量；
＊避免引物二聚體和(hé)二級結構；
＊引物對的(de)Tm值應該接近。
⑤引物序列有(yǒu)插入或缺失？
＊使用上遊和(hé)下遊引物多測幾個克隆。
＊請選擇正确的(de)純化方法。
⑥ PCR無結果？
＊請檢查引物設計是否正确；
＊請檢測OD讀數是否正确；
＊做(zuò)一(yī)個陽性對照和(hé)一(yī)個陰性對照

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