一(yī)

實驗原理(lǐ)

PCR 技術，即聚合酶鍊反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國(guó) PE Cetus 公司的(de) Kary Mullis 在 1983 年(nián)（1993 年(nián)獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的(de)。

這項技術可(kě)在試管內(nèi)經數小時反應就将特定的(de) DNA 片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一(yī)核酸片段的(de)技術在分子(zǐ)生物學(xué)研究中具有(yǒu)舉足輕重的(de)意義，極大地(dì)推動了生命科(kē)學(xué)的(de)研究進展。它不僅是 DNA 分析最常用的(de)技術，而且在 DNA 重組與表達、基因結構分析和(hé)功能檢測中具有(yǒu)重要的(de)應用價值。

PCR 可(kě)以被認為(wèi)是與發生在細胞內(nèi)的(de) DNA 複制過程相似的(de)技術，其結果都是以原來的(de) DNA 為(wèi)模闆産生新的(de)互補 DNA 片段。細胞中 DNA 的(de)複制是一(yī)個非常複雜的(de)過程。參與複制的(de)有(yǒu)多種因素。PCR 是在試管中進行(xíng)的(de) DNA 複制反應，基本原理(lǐ)與細胞內(nèi) DNA 複制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR 由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

① 模闆 DNA 的(de)變性：模闆 DNA 經加熱至 94℃ 左右一(yī)定時間後，使模闆 DNA 雙鍊或經 PCR 擴增形成的(de)雙鍊 DNA 解離(lí)，使之成為(wèi)單鍊，以便它與引物結合，為(wèi)下輪反應做(zuò)準備；

② 模闆 DNA 與引物的(de)退火 （複性）：模闆 DNA 經加熱變性成單鍊後，溫度降至 55℃ 左右，引物與模闆 DNA 單鍊的(de)互補序列配對結合；

③ 引物的(de)延伸：DNA 模闆--引物結合物在 Taq 酶的(de)作用下，以 dNTP 為(wèi)反應原料，靶序列為(wèi)模闆，按堿基配對與半保留複制原理(lǐ)，合成一(yī)條新的(de)與模闆 DNA 鍊互補的(de)半保留複制鍊。

重複循環變性--退火--延伸三過程，就可(kě)獲得更多的(de)「半保留複制鍊」，而且這種新鍊又可(kě)成為(wèi)下次循環的(de)模闆。每完成一(yī)個循環需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能将待擴目的(de)基因擴增放大幾百萬倍。

二

實驗試劑與器材

模闆 DNA、2.5 mmol/L dNTP

Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、SSR 引物

10 ×buffer、15 mmol/L Mg²⁺、ddH₂O

PCR 儀、移液槍、PCR 闆

三

實驗步驟

1.配制 20 μL 反應體系，在 PCR 闆中依次加入下列溶液：

模闆 DNA	2 μL
引物 1	1 μL
引物 2	1 μL
dNTP	1.5 μL
MgCl₂	2 μL
10×buffer	2 μL
ddH₂O	10 μL
Taq 酶	0.5 μL

2.  設置 PCR 反應程序。

3.上樣，啟動反應程序。

4.擴增産物的(de)電泳檢測。

四

PCR的(de)技術應用

1.生命科(kē)學(xué)

a、人類基因組計劃

随着 PCR 的(de)日臻完善，科(kē)學(xué)家于 2003 年(nián)在完成的(de)人類基因組「工作框架圖」的(de)基礎上，經過整理(lǐ)、分類和(hé)排列後得到更加準确、清晰、完整的(de)基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的(de)首次揭示，表明科(kē)學(xué)家們(men)開始部分「讀」出人類生命「天書」所蘊涵的(de)內(nèi)容。

b、後基因組計劃

人類基因組 DNA 序列圖譜完成後，鑒定基因組多态性及其單倍型以及尋找其在生物和(hé)醫學(xué)應用中，成為(wèi)人們(men)關(guān)心的(de)熱點。以研究基因功能為(wèi)核心的(de)「後基因組時代」已經來臨，大規模的(de)結構基因組、蛋白質組以及藥物基因組的(de)研究計劃已經成為(wèi)新的(de)熱點。

c、物種的(de)分類、進化及親緣關(guān)系

可(kě)以進行(xíng)物種進化的(de)保守性分析、物種多态性分析及物種鑒定。

2.醫藥

a、疾病的(de)診斷和(hé)治療

遺傳性疾病，如(rú)地(dì)中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子(zǐ)缺乏等有(yǒu)遺傳傾向的(de)疾病，尤其是老年(nián)性疾病，如(rú)糖尿病、高(gāo)血脂症，甚至腫瘤中的(de)一(yī)部分均可(kě)預測；癌基因的(de)檢測和(hé)診斷，檢測惡性腫瘤的(de)标記物來診斷癌症等疾病；利用基因治療方法治療腫瘤性疾病。

b、緻病病原體的(de)檢測

檢測範圍包括細菌、病毒（SARS 、禽流感病毒 H5N1 等）、原蟲及寄生蟲、黴菌、立克次體、衣原體和(hé)支原體等一(yī)切微生物。檢測的(de)靈敏度和(hé)特異性都遠高(gāo)于當前的(de)免疫學(xué)方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養的(de)病毒（乙肝），細菌（如(rú)結核、厭氧菌）和(hé)原蟲（如(rú)梅毒螺旋體）等來說尤為(wèi)适用。

c、DNA 指紋、個體識别（DNA 身份證）、親子(zǐ)關(guān)系鑒别和(hé)法醫物證

可(kě)以用一(yī)根頭發、一(yī)個細胞、一(yī)個精子(zǐ)來完成上述工作，這一(yī)領域也已發展到骨髓或髒器移植配型。

d、生物工程制藥

許多藥物可(kě)通過工程菌和(hé)細胞來大量生産，如(rú)幹擾素、白介素、促紅(hóng)細胞生長(cháng)素等藥物。

e、轉基因動物制藥及疾病模型

轉基因動物與醫學(xué)及生物醫藥研究的(de)關(guān)系越來越密切。近年(nián)來，各種人類疾病轉基因動物模型不斷建立。如(rú)轉基因動物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高(gāo)血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫學(xué)、藥理(lǐ)學(xué)研究中的(de)應用。

利用轉基因動物-乳腺生物反應器生産藥物蛋白，好比在動物身上建「藥廠」，可(kě)以從動物乳汁中源源不斷地(dì)獲得具有(yǒu)穩定生物活性的(de)基因産品。這是一(yī)種全新的(de)藥物生産模式，具有(yǒu)投資成本低(dī)，藥物研制周期短(duǎn)和(hé)經濟效益高(gāo)等優點。

3.農業科(kē)學(xué)

a、轉基因植物

按其功能主要分提高(gāo)産量、抗病力、抗除草(cǎo)劑、改良品質和(hé)發育調節。如(rú)大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。

b、轉基因動物

在農業方面，主要在改良畜禽生産性狀，提高(gāo)畜禽抗病力及利用轉基因畜禽生産非常規畜産品。

4.考古學(xué)及曆史事件解讀

利用人類短(duǎn)串聯重複 STR-PCR 技術，研究人類種族的(de)遺傳多态性，效果非常穩定。目前此技術已廣泛用于生物考古、種系發育、民族學(xué)、人類學(xué)和(hé)考古學(xué)等各個領域中。

5.衛生安全

a、食品微生物的(de)檢測

傳統的(de)緻病菌檢測首先經過長(cháng)時間的(de)培養，費時費力，應用 PCR 技術則非常迅速、準确。主要用于：食品緻病菌的(de)檢測，如(rú)肉毒唆菌等；乳酸菌的(de)檢測；水中細菌指标測定。

b、轉基因食品的(de)檢測

目前世界轉基因食品已經有(yǒu) 100 多物種，大多數已經用于食品。轉基因食品對人體健康的(de)危害及對生态的(de)影響也日受世界廣泛的(de)重視(shì)，因此對轉基因食品的(de)檢測成為(wèi)控制其泛濫的(de)一(yī)種手段。

c、動、植物檢疫

靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我(wǒ)國(guó)進出口口岸的(de)門衛，檢查出入國(guó)門的(de)人員、動、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染病（艾滋、動物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段将這些病菌拒之于國(guó)門之外，是提高(gāo)我(wǒ)國(guó)綜合國(guó)力的(de)必要保證。